赛默飞世尔Prima PRO 在线质谱仪发酵和细胞培养过程中的气体分析 质谱应用

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发酵和细胞培养过程中的气体分析质谱应用  

作者： Graham Lewis  

关键词
• 生物技术                           • 发酵                                       • 逃逸气体分析                                      • 快速多气流取样
• 扇形磁场                           • 耗氧速率                                • 二氧化碳释放率                                   • 呼吸商

简介
发酵过程用于在各种行业生产各类关键产品：
制药： 抗生素、疫苗、预防剂、激素
生物能源： 以低值、非食物物质为原料的生物乙醇燃料
生物材料： 能源效率、生物降解塑料
动物营养学： 饲料添加剂、氨基酸其他重要发酵产品包括工业酶、食品添加剂和维生素。

    按照定义，“发酵”一词指的是厌氧过程（在缺氧情况下进行的过程）。如果存在氧气，则过程是好氧过程，并应称作“需氧”。但是，在生物技术中，“发酵”这个词的使用较不确切，它可以指食物中的微生物在好氧或厌氧条件下生长。本白皮书将使用后一个定义。

发酵
    发酵是微生物学家描述通过大量培养微生物的方法生产化合物所使用的术语。该产品可以是细胞本身（生物质生产）、微生物自身的代谢物或异质产物。使用氧气执行其代谢作用的微生物被称作好氧微生物。某些微生物可用硝酸盐或硫酸盐替代氧气，因此可在缺氧的情况下生长。这些微生物被称作厌氧微生物。
    有 3 种不同的发酵过程。在批量发酵中，将微生物灌输到发酵罐中的无菌营养液中，并进行培养。在发酵过程中，添加氧气（在使用好氧微生物的情况下）和酸或碱以控制酸碱度。细胞活动通常会导致培养基的成分、生物质浓度和代谢物浓度不断变化。分批补料发酵可增强封闭批量处理，方法是在发酵过程中以增量方式添加基质。在持续发酵过程中，设置开放系统，并将无菌营养液持续添加到生物反应器。同时，从系统提取含有微生物的已转换的等量营养液。

     微生物发酵可视作三相系统，它涉及液体-固体、气体-固体和气体-液体反应。液相包含溶解营养物、溶解基质和溶解代谢物。固相包括个别细胞、小球、不溶基质或沉淀代谢产物。气相为氧气供应和二氧化碳去除提供贮存器。

     典型的试验规模发酵罐如图 1 中的示意图所示。

图1：典型的试验发酵罐

气体分析的需求
     在任何发酵过程中，监测培养物状态是很重要的，因为它的健康决定营养物的转换率，多余副产品的形成，以及（在最糟糕的情况下）出现中毒。分析输入并从发酵罐排出的呼吸气体是特征化发酵过程的最佳方法。它是非侵入方法，允许监测发酵的生理状态，包括生长动力学和基质消耗。此外，它有助于确定停止流程的最佳点以最大化产量。

为何在气体分析时使用质谱分析法？
     许多发酵过程以发酵关键阶段的氧气和二氧化碳浓度的细微变化为特征，例如当微生物与营养物相处于平衡状态时出现的迟滞期。用于测量逃逸气体的方法具有快速和精确的分析能力是至关重要的。质谱分析 (MS) 的速度令其特别适合用于发酵应用。但是，速度不得以精确度为代价；获得精确的数据以确保浓度的细微变化不会被遗漏同样很重要。

扇形磁场 MS 的优点
      监测发酵过程可使用两种类型的 MS：扇形磁场，其带电粒子在可变磁场中被分离，以及四极，其带电粒子在可变射频场中被分离。我们生产四极和扇形磁场质谱仪 - 超过 30 年的行业经验确保我们基于扇形磁场的分析仪为发酵逃逸气体分析提供最佳的性能1， 2。扇形磁场分析仪的主要优点包括更高的精确度、准确性、较长的校准间隔时间，以及抗污染能力。通常，分析精确度比四极分析仪高出 2 到 10 倍，具体取决于被分析的气体和混合物的复杂性。图 2 显示扇形磁场质谱分析仪的原理图。

图2：扇形磁场 MS 原理图

      在扇形磁场分析仪上，任何特定质量位置的信号强度均显示为平顶波峰。这意味着质量标度的任何细微变化将不会导致信号强度的改变。对于提供圆形波峰的四极质谱仪，情况并非如此。用于 Thermo Scientifc™ Prima 系列质谱仪的扇形磁场分析仪采用叠层结构，能够以相当于四极分析仪的速度进行扫描，并提供快速分析和高可靠性的独特组合。这允许快速和极为稳定地分析不限数量的用户定义气体。

    快速多气流取样

     如果使用 MS 监测多个发酵罐，那么必须采用快速和可靠的方法以切换不同的气流。电磁阀歧管的死区体积太大，而旋转阀的可靠性较差，因此我们开发独特的快速多气流取样器 (RMS)。它将取样速度和可靠性进行完美整合，并允许从最多 64 个气流选择样本。
     气流沉淀时间取决于应用，并且可完全由用户进行配置。 RMS 包括每个选定气流的数字样本流量记录。如果样本流量下降，这可用于触发警报，例如，如果样本调节系统中的过滤器堵塞。 RMS 经过加热，即使是最具“粘性”的挥发物也能快速作出响应。

    呼吸商
    呼吸是生物体氧化食物以产生能量的过程。发酵过程中的重要控制参数是呼吸商 (RQ)。这是二氧化碳释放率 (CER) 与耗氧速率 (OUR) 的比率（表 1）。  

发酵逃逸气体分析的参数和呼吸商

    准确确定 RQ 取决于确定进出发酵罐的流量比率。通过扫描 MS 可轻松确定此比率，除测量 O2 和 CO2 之外，它也可用于测量 N2 和空气。这两种气体中，至少有一种气体对过程是惰性的，因此它可用于有效校正湿度变化，当干燥空气原料气体被鼓入发酵罐液体时可能发生这种变化。如果未进行该项校正操作，由于被额外的水蒸气稀释，顶部空间数据可能出现错误3。等式 1 显示使用氮计算 RQ 进行流量校正。作为发酵应用程序的一项标准功能， Thermo ScientifcGasWorks 软件可计算 RQ 。

等式 1： MS 计算的呼吸商

    图 3 显示使用质谱仪测量 RQ 值触发添加葡萄糖以最大化分批补料发酵中的活细胞密度的范例。在此范例中，混合营养物专为在大约 250 小时的时间内提供最佳营养而设计，以确保细胞密度迅速增加。一旦质谱仪指出消耗最后的葡萄糖后 RQ 已降至低于 0.8，那么将添加葡萄糖，以便生物质继续生长。当触发第二次添加葡萄糖时，下一个控制点被设为略高于 0.85。此控制程度只能通过极为精确的 RQ 测量来实现。没有其他技术可匹配此精度水平。值得注意的是，在发酵过程刚开始时精确度较低，这是因为此时的耗氧量极低，并且信噪比相对较低。此周期称作迟滞期，在此期间，细胞计数极低。一旦生物体开始繁殖，精确度将迅速提高。  

图3：MS 生成的分批补料发酵的呼吸商 (RQ) 数据  

  在四极仪器上，此干扰电平高得多并且会发生变化，造成低电平乙醇测量的不确定因素过多。实际上，低电平乙醇信号会“淹没”在氧峰值的噪波中。使用扇形磁场仪器，测量具有极高的可重现性，并且能够以低至 10 ppm 的精确度测量甲醇和乙醇。我们的 Thermo Scientifc Prima PRO 扇形磁场 MS 的标准性能规格如表 3 所示。精确度是在 24 小时内观察到的标准偏差。注意：在 24 小时内测量氧气时可实现极高的精确度 - 0.05%（相对）。所有 6 种成分的分析时间（包括气流切换时间）为每气流 20 秒。如果在分析时忽略甲醇和乙醇，则每气流的分析时间可缩短至 10 秒。

表 3： 扇形磁场 MS 标准性能规格范例。 **以较高者为准。包括切换

时间的分析时间（上述 6 种成分 20 秒／气流）。

从实验室扩大至批量生产
    生产过程通常以实验室的细胞培养物生长开始。然后，在扩大过程中，细胞连续转移到越来越大的发酵罐，最终转移到可容纳最多 20,000 升生长培养基和细胞的生产容器中。
    它对于维持特定细胞保持健康和生长所需的精确环境至关重要 - 这要求获得扩大过程的每个阶段（从实验室到试验工厂再到批量生产）的精确逃逸气体分析数据。在某些情况下，配备合适的 RMS 多气流进口的单台质谱仪可监测所有发酵罐，而在其他情况下，必须在实验室和工厂使用单独的 MS 分析仪。两个分析仪平台的结果相互关联，确保通过不同的扩大阶段实现平稳过渡，这点至关重要。  

     图 4A 显示适合发酵过程开发的质谱仪的范例Thermo Scientifc PrimaBT MS，图 4B 显示适合生产过程监测的质谱仪的范例 Thermo Scientifc
Prima PRO MS。两套系统共享 Thermo Scientifc扇形磁场分析仪，以执行高精度多成分气体分析，并且两套系统均提供高度可靠的快速多气流取样器。

图 4： A. Prima BT 过程开发 MS。 B. Prima PRO 过程 MS。

    长期稳定性数据

    Prima BT 台式气体分析质谱仪经过配置，可在7 天内持续分析压缩空气气瓶中的氮气、氧气、氩气和二氧化碳，不会中断并且无需重新校准。测量这 4 种成分的分析循环时间为 5 秒。下方的表 4 显示结果的统计摘要。  

表 4： Prima BT 质谱仪的长期稳定性数据范例。

     图 5 提供 4 种气体读数的图形显示，数据源于Thermo Scientifc GasWorks 软件的 Data Review Plus模块。此长期稳定性只能通过扇形磁场 MS 实现 - 四极质谱仪要求频繁校准以校正固有偏差。

  

图 5： Prima BT 质谱仪的长期稳定性数据。 ThermoScientifc GasWorks 软件的氩气 (% mol)、

二氧化碳(ppm)、氮气 (% mol)，及氧气 (% mol)（从上到下）图表  

总结
    扇形磁场质谱仪已证明在分析发酵排出气体时具有最高的精确度，多年来，它已在全球多家领先的生物科技和制药公司成功监测发酵罐排出气体。通过整合高速度和出色的稳定性，扇形磁场分析仪特别适合高要求应用。

Thermo Scientifc Prima BT 和 Prima PRO 质谱仪可在发酵和细胞培养过程的每个阶段

进行快速、精确的逃逸气体分析（从实验室到试验工厂再到批量生产）

参考资料

1.David Pollard， Jens Christensen， Merck & Co. Inc，美国新泽

西州拉威市。排出气体分析。工业生物技术百科全书：生物过

程、生物分离及细胞计数， 2010年， John Wiley & Sons。

2.Joseph S. Alford， Eli Lilly， Indianapolis， IN USA。生物过程

控制：优势和挑战。计算机和化学工程第 30 卷， 2006 年。

3.P.C. van der Aar， A.H. Stouthamer， H.W. van Verseveld，

荷兰阿姆斯特丹自由大学生物学实验室微生物学部门。对在经

过搅拌的微生物培养物中测量 O2 消耗和 CO2 产生可能存在

误解。微生物学方法期刊第 9 卷，第 4 期， 1989 年。