色谱分析分离方法概述

BrainStorm

第一章 色谱法的发展及其在分析化学中的地位和作用
第一节  色谱法的发展
        一、色谱法的出现

        二、色谱法的发展
        三、色谱法的现状和未来

   在茨维特提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明。直到1931年德国的Kuhn和Lederer才重复了茨维特的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素。Martin和Synge在1940年提出液液分配色谱法，即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。1941年Martin和Synge提出用气体代替液体作流动相的可能性，11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法，因而获得了1952年
的诺贝尔化学奖。在此基础上1956年Golay开创了开管柱气相色谱法，习惯上称为毛细管柱气相色谱法。1956年VanDeemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。另一方面早在1944年Gonsden等就发展了纸色谱，1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。在60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（HPLC）。80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，但在90年代后未得到较广泛的应用。而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳（CZE），在90年代得到广泛的发展和应用。同时集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视。到56世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥他不可代替的重要作
  色谱法经过近一个世纪的发展，各种方法发展不平衡。McNair认为气相色谱（GC）可能是
世界上应用最广的分析技术，他仍处于上升的趋势，有报告估计GC仪器和备件在世界市场上
高达10亿美元，并将以3%——4%逐年增长，其中软件35%，硬件65%。所以如此，是因为气相色谱的灵敏度高，分离度好，分析速度快，定量分析的精密度优于1%。将来的发展趋势是增强自动化，特别是计算机工作站的应用，以及专门的进样装置与气相色谱仪的一体化，包括顶空、吹扫捕集、固相萃取、超临界流体萃取和加速溶剂萃取。GC/MS将以5%——10%的速度增加，GC/FTIR会维持现状，GC/NMR会有商品仪器问世。
    高效液相色谱（HPLC）近年以6%——8%的速度增长，其中活跃的领域是离子色谱（IC），疏
水作用色谱（HIC），手性分离及普遍使用的反相色谱，HPLC除具有GC的优点外，还有应用面广，
可以进行制备分离，在生命科学中有很大的应用前景。HPLC的仪器市场尚未成熟，他将持续增长，主要在LC/MS系统以及开发更为简单便宜的系统。
    G.Guiochon认为GC和HPLC在分离分析领域发展最好，是极为成功的范例，而超临界流体色谱（SFC）和场流分离（FFF）则处于失利的境地，毛细管区带电泳（CZE）和电色谱则处于前途未卜的状态。关于超临界流体色谱（SFC）是Giddings和Myers早在60年代就进行了先驱性的研究工作，在80年代初期掀起SFC的热潮，而且当时认为SFC将掀起分析方法的革命，但是目前各大公司却纷纷撤消SFC的推销，放弃进一步开发SFC的计划。毫无疑问SFC具有一些独特用途，但是他被挤在气相色谱和高效液相色谱之间，而GC和HPLC已成为广泛应用的技术，所以SFC命中注定处于被束之高阁的地位。
    毛细管区带电泳（CZE）于80年代初引起分析化学家极大的兴趣，由于他具有惊人的高柱效，使许多分析化学家趋之若鹜地奔向CZE，许多色谱学家也都转向CZE，希望他能解决一切分离问题。但是许多工业分析化学家现在沮丧了，因为虽然CZE具有很高的柱效，但是他失去了色谱方法灵活调节分离因子的机动性，他难以成为定量分析的手段，CZE分析结果的偏差要比HPLC整整大一个数量级，这是一个极大的障碍。仪器制造商们眼巴巴地看着销售额的下降。CZE只有他成为一个真正的定量分析方法之后才能获得广泛的应用。要解决这一困难的问题，需要付出十分艰辛的研究。
    现在电色谱（EC）成为这一领域的新秀，很多人希望EC能获得成功，尽管要下一个结论还
为时尚早，但是EC驱动流动相的方式和CZE相同，都是使用了电渗流，这种流动速度的波动造成CZE在定量分析中的误差来源，要克服这一困难是近期具有挑战性的研究任务。
    有许多理由说明SFC和场流分离（FFF）是不够成功的，他们不能成为分析方法的主流。而
CZE和EC是在苦难地挣扎之中，要使之成功和普及并成为定量分析方法必须具备：①易于使用，操作费用低；②能够得到准确、可重复的定量结果；③要能够解决至少一个分析化学中的重要问题。在所有这三个问题中，他的功能必须超过其他技术。在20世纪60年代的GC和70年代的HPLC就是这样的。SFC，CZE和EC是很重要的分析分离方法，都有自己的某些特殊的优点，他们如能满足上述要求就会得到广泛的应用。不过CZE还是具有极大的机遇的，用他来分析生物大分子有非常突出的优点，只要把他的定量分析精度明显地提高，他会蓬勃发展，成为极其重要的分析方法。

未完待续

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沙发.....

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1.典型的色谱图
    在用热导检测器时， 往色谱仪中注入带有少量空气的单一样品时， 得到图1-3-4的典型气相色谱图。在图1-3-4中当没有样品进入色谱仪检测器时0t是噪声随时间变化的曲线， 一般是一条直线， 叫作 “基线” 。 h是峰高， 其他符号将在后边解释。

2. 区域宽度
    区域宽度是色谱流出曲线中很重要的参数， 它的大小反映色谱柱或所选色谱条件的好坏。区域宽度有以下三种表示方法：
（1） 半高峰宽 （peak width at half height） （Wh/2） 是在峰高一半处的色谱峰的宽度， 即图 1-3--2中的CD ， 单位可用时间或距离表示。
（2） 峰宽 （peak width） （W ） 是在流出曲线拐点处作切线， 在图1-3-2中于基线上相交于
E，F 处， 此两点间的距离叫峰宽， 有些色谱书上叫做 “基线宽度” 。
（3） 标准偏差 （σ ） 在图 1-3-2中AB距离的一半叫标准偏差。
在这三种表示方法中以前两者使用较多， 三者的关系是：

3. 保留值 （retention value） 保留值是总称， 具体参数的名称有以下一些：
（1） 死时间 （dead time）(tM) 一些不被固定相吸收或吸附的气体通过色谱柱的时间， 如用热导池作检测器时， 从注射空气样品到空气峰顶出现时的时间， 以s或min为单位表示。
（2） 死体积 （dead volume） （Vm） 指色谱柱中不被固定相占据的空间及进样系统管道和检
测系统的总体积， 等于死时间乘以载气的流速。
（3） 死区域 （dead zone） （ Vg） 指色谱柱中不被固定相占据的空间。
（4） 保留时间 （retention time） （ tR） 从注射样品到色谱峰顶出现时的时间， 以s或min为单位表示。
（5） 调整保留时间 （adjusted retention time）保留时间减去死时间即为调整保留时间
（tR-tM） 。
（6） 保留体积 （retention volume） （ Vr） 从注射样品到色谱峰顶出现时， 通过色谱系统载气的体积， 一般可用保留时间乘载气流速求得， 以mL为单位表示。
（7） 调整保留体积 （adjusted retention volume）保留体积减去死体积即为调整保留体积 （Vr-Vm） 。
（8） 净保留体积 （net retention volume） （Vn） 经压力修正的调整保留体积，
即：
式中 j—色谱柱进口和出口之间的压力梯度校正系数。

式中  Pj—色谱柱进口压力；
      Po —色谱柱出口压力。
（8） 比保留体积 （specific retention volume） （Vg） 把净保留体积进一步校正到单位质量固定液和273K时的保留体积， 如下式：

式中     VL—固定液的体积；
         ρL--固定液的密度；
         VLρL—固定液的质量。
（10） 相对保留值 （reative retention）在一定色谱条件下被测化合物和标准化合物调整保留时间之比。


很多文献用分离因子 （Spearation factor）α来表示相对保留值，

（11） 保留指数 （retention index）（I） 保留指数是1958年克瓦茨 （Kovats） 提出来的， 用以表示化合物在一定温度下在某种固定液上的相对保留值， 具体说它是以一系列正构烷烃作标准的相对保留值， 其定义如下：


【例】 求在120℃下正丁醇在SE-30固定液上的保留指数差。
在SE-30固定液上测得正丁醇的保留指数为643；在角鲨烷固定液上测得正丁醇的保留指数为590。

4.容量因子 （capacity factor）,容量因子 （也称为分配容量） 的定义是在平衡状态下组分在固定相与流动相中质量之比，
即
式中  VL—色谱柱内固定相的体积；
      VG—色谱柱内流动相的体积。
从上述定义可导引出下列的关系式：

（1-3-12） 式中的β叫做 “相比率” 。其含义是在色谱柱中流动相体积和固定相体积之比。填充柱气相色谱柱的β值在5-35的范围， 而毛细管气相色谱柱的β值在50-200的范围。
5.色谱柱的柱效率和分离度
（1） 柱效率 （column efficiency）和溶剂效率 （solvent efficiency）
    色谱理论主要包括两方面的问题， 即柱效率和溶剂效率。柱效率是指溶质通过色谱柱之后其区域宽度增加了多少， 它与溶质在两相中的扩散及传质情况有关， 这是所谓色谱的动力学过程。溶剂效率是与两个物质在固定相上的相对保留值大小有关， 从微观角度讲是与两个物质和固定相 （在液相色谱中还与流动相） 的分子间作用力不同有关。这是所谓色谱的热力学过程。柱效率常以理论塔板数（n）或理论塔板高度（H）表示。而溶剂效率是以相对保留值表示。要提高柱效率， 就得改善色谱柱性能和操作条件； 要提高溶剂效率就得提高固定相的选择性。
（2） 理论塔板数（n）的计算和测定 色谱柱的柱效率可以用理论板数（n） ， 也可以用理论板高 （HEPT） （H） 表示。   
        H=L/n
式中   L是色谱柱的柱长,L,H均以mm表示。
计算理论塔板数（n）的计算公式是：

    测定理论塔板数（n）是在一定的色谱条件下（即一定的色谱柱，一定的柱温、流速下），注入某一测试样品，记录色谱图，测定色谱峰的半高峰宽（或峰宽）和进样点到色谱峰极大点的距离，二者的单位要一致。如半高峰宽(Wh/2)=2mm，进样点到色谱峰极大点的距离(tR)=18mm按公式（1-3-15）计算得

（3）有效板数（neff）为了消除色谱柱中死体积对柱效的影响，人们常用有效理论塔板数（neff）表征色谱柱的实际柱效，按下式计算

相应的有效理论塔板高度（Heff）为

（4） 溶剂效率 溶剂效率是固定相对某两个混合物分离能力的表征，即用值表示：

值又称作分离因子（α）、“选择性因子”，是描述固定相分离混合物能力的参数。
（5）分离度（resolution）（R）分离度又称作分辨率。是把柱效率和溶剂效率结合在一起的参数，是表示色谱柱在一定的色谱条件下对混合物综合分离能力的指标。在色谱文献中有下列一些表示方法：
①分离度（R）如两个物质的峰高相当，分离度（R）是2倍的峰顶距离除以两峰宽之和：

当R=1时， 两峰的峰面积有5%的重叠， 即两峰分开的程度为95%。当R=1,5时， 分离程度可达到99.7%， 可视为达到基线分离。
②半高峰宽分离度（R1/2）和R近似，只是用半高峰宽代替峰宽度。

③峰高分离度（Rh）当一对被分离物质分离较差时，可用峰高分离度表示，用下式进行计算

hI、hM的定义如图1-3-5。

6.各色谱参数间的关系
（1） 保留时间和分配容量的关系

这是一个在色谱中很重要的公式， 也可以写成下式：

式中 —载气的平均线流速；
      L —色谱柱柱长。
从 （1-3-23）式可导出

（2）分离度、柱效率和容量因子间的关系当某一物质对用某一色谱柱进行分离时，此两物质的α和K'已知，要使它们的分离度达到R，要求色谱柱的Nne为

把（1-3-25）改写一下，又可得到下边的重要公式：

公式（1-3-26）可由前边的公式（1-3-16），（1-3-17），（1-3-22）和（1-3-25）导出。

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